Metódy molekulárnej biológie

Last updated 03 May 24 Edit Source

Separácia DNA a RNA, migrujú v elektrickom poli cez agarózový gel ku anóde (lebo sú záporné)
Rozdeľujú sa podľa veľkosti molekuly (ako veľmi sa zasekávajú, pomer m/z je cca rovnaký)

• menšie rýchlejšie
• väčšie pomalšie

Vizualizácia => interkalačné činidlá - viažu sa do veľkého žliabku DNA (mutagény) - etídium bromid
Potom UV vizualizácia -> naviazané farbivá svietia

Na to aby sme vedeli cca veľkosť sa používa tzv. leader -> známe veľkosti (2, 4, 6, 8, 10kb)

Najredší gél je 0.7%
Pri menších veľkostiach sa musí používať hustejší gél a niekedy aj kapiláry.
Napr. pri sekvenovaní sa používajú 300b dlhé fragmenty

Používajú sa aj farbivá na estimation toho nakoľko už proces prešiel, putujú cca ako DNA
-> brómfenolová modrá, xyléncyanol

Pri plazmidoch sa tvoria 3 bandy -> (kruhová, lineárna a superšpiralizovaná)

Pri RNA treba denaturovať sekundárne štruktúry -> formamid, močovina
Pri separácii RNA z bunky sa objavujú 2 veľké bandy -> rRNA

Extrakcia z gélu sa robí buď vyrezaním alebo rozpustením

PFGE?? pulse field electrophoresis

-> Electrophoretic mobility shift assay

Väzba proteíny na NK -> spomalenie migrácie
NK značené radioaktívne cez (fosfor P-32)

-> Polyakrylamidová gélová elektroforéza

Separácia proteínov
Pridáva sa SDS (sodium dodecylsulphate) na denaturáciiu a udelenie náboja proteínom
Gél => zmes akrylamidu a bisakrylamidu
Je to vertikálny gél
Farbí sa s Coomassie R-250 Brilliant Blue

!!! - mutacie sa oznacuju (originalna baza) + miesto + (nova baza)

1. rozmer: nedenaturačná izoelektrická fokusácia (podľa izoelektrického bodu)
2. rozmer: denaturačné page

Izoelektrická fokusácia funguje cez

Prenos separovaných NK alebo prot na membránu -> špecifická próba alebo protilátka -> detekcia

• Southern blot: DNA
• Northern blot: RNA
• Western blot: proteíny

Prenos RNA z gélu na kladne nabitú nylonovú membránu (elektricky alebo kapilárne)
Detekcia sa robí hybridizáciou (RNA komplementarita) s radioaktívne alebo inak značenou próbou
Vizualizácia expozíciou na film alebo fosforovým skrínom
Špecificita záleží na teplote a salinite (vyššia pri -> ⬆️ teplota, ⬇️ salinita)

Používa sa väčšinou na overenie vloženia sekvencie do génomu
Najprv sa DNA reštrikčne naštiepi

Presun z PAGE gélu na nitrocelulózovú alebo PVDF membránu
Na rozoznávanie sa používajú protilátky - monoklonálne (špecifické) vs polyklonálne

Vizualizácia (podľa toho čo je naviazané na sekund. protil.):

• kolorimetrická - enzým, ktorý štiepi farbivo
• chemiluminiscencia - enzým, ktorý chemicky tvorí svetlo
• fluorescencia - fluorescenčné farbivo

  Stokesov posuv

Enzýmy ktoré štiepia DNA na určitých miestach podľa sekvencie
Štiepia palindromické sekvencie a stále symetricky (lebo sú to vlastne dimérne enzýmy)

Môžu tvoriť:

• blunt konce
• sticky konce

Fok1 - štiepi 9bp a 13bp downstream od rozoznávaného miesta